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四大重要特點(diǎn)讓DNA聚合酶得到了改進(jìn)

發(fā)布日期: 2019-12-18
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   DNA聚合酶在新DNA鏈合成中扮演著重要的角色,是PCR反應(yīng)*的組成部分。因此,充分了解聚合酶的特點(diǎn)以及高級(jí)DNA酶今后的發(fā)展方向,對(duì)于將PCR方法推廣到各種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用至關(guān)重要。自從在早期PCR實(shí)驗(yàn)中開(kāi)始使用TaqDNADNA聚合酶至今,其特異性、熱穩(wěn)定性、保真度和合成能力得到了明顯的改進(jìn)。在選擇之前,先了解一下DNA聚合酶的四個(gè)重要特點(diǎn):熱穩(wěn)定性,保真度,擴(kuò)增速度及特異性。
  熱穩(wěn)定性
  熱穩(wěn)定性是指DNA聚合酶能夠耐受高溫的能力。不同的DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性差異較大,一般通過(guò)半衰期來(lái)體現(xiàn)。由于熱循環(huán)是DNA擴(kuò)增重復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件的關(guān)鍵特征,因此,所使用DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性非常重要。盡管初來(lái)自于嗜熱菌菌株的TaqDNA聚合酶可耐受相對(duì)較高的溫度,但是其半衰期在90°C以上時(shí)明顯縮短。當(dāng)使用長(zhǎng)時(shí)間高溫使具有二級(jí)結(jié)構(gòu)和富含GC序列的DNA變性時(shí),這一缺陷便成為一大難題。
  保真度
  保真度是指DNA聚合酶復(fù)制DNA模板的能力。部分DNA聚合酶具有3’-5’的核酸外切酶活性,能夠校正錯(cuò)誤堿基。保真度的高低可通過(guò)錯(cuò)配率來(lái)體現(xiàn)。DNA聚合酶的校正能力決定了保真度,會(huì)影響DNA序列復(fù)制的準(zhǔn)確性。因此,高保真DNA聚合酶就是具有強(qiáng)校正活性的酶。DNA聚合酶準(zhǔn)確復(fù)制DNA序列(即獲得無(wú)錯(cuò)誤序列)的能力對(duì)分子克隆、測(cè)序和定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用至關(guān)重要。
  擴(kuò)增速度
  擴(kuò)增速度是指在延伸時(shí),DNA聚合酶向DNA新鏈中摻入核苷酸的速率。擴(kuò)增速度除與DNA聚合酶有關(guān),還會(huì)受到延伸溫度,緩沖液及模板復(fù)雜程度等的影響。
  特異性
  特異性是指DNA聚合酶在PCR過(guò)程中只擴(kuò)增目的片段的能力。為了提高PCR特異性,常通過(guò)抗體法或配體法等方式對(duì)DNA聚合酶進(jìn)行修飾,使酶活性在低溫條件下封閉,減少非特異性延伸和擴(kuò)增。
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